磁珠法体液DNA提取试剂盒
分类：体液DNA提取目录：DE01
产品特性：
| 高通量：40min即可完成提取过程 |
| 环境安全：不含有害有机溶剂 |
| 抗凝剂普适：可用于各种抗凝剂 |
| 自动化适用：提供预装板适配核酸自动提取仪 |
操作流程（示意图例）：
磁珠法基因组DNA提取试剂盒在胃液样本提取幽门螺杆菌核酸的应用实例见下。
1.标本
快速尿素酶阳性（RUT+）胃液标本35例
2.试剂
①EmerTher磁珠法基因组DNA提取试剂盒；②QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN)。
3.标本核酸提取方法
胃液预处理
取1ml的胃液加入1.5ml的离心管中，加入等量的Tris缓冲液（0.67M，pH7.4），振荡均匀，室温放置2h。13000rpm离心5min，弃上清留沉淀。
EmerTher磁珠法基因组DNA提取试剂盒：
• 经预处理的胃液沉淀中加入700μl 裂解吸附液，混和均匀，裂解细胞6min；
• 加入30μl磁珠悬浮液，振荡混合10min。用磁分离架吸附磁珠，弃上清；
• 加入800μl 洗涤液I 洗涤磁珠，吸附磁珠，弃上清；
• 再次加入800μl洗涤液I 洗涤磁珠，吸附磁珠，弃上清；
• 加入800μl 洗涤液II 洗涤磁珠，吸附磁珠，弃上清；
• 再次加入800μl 洗涤液II 洗涤磁珠，吸附磁珠,弃上清后静置3-6min，去除乙醇残留；
• 加入 100μl Nuclease-Free Water，混和均匀后洗脱5min；
• 吸附磁珠，回收含基因组DNA的洗脱液至另一离心管，进行DNA检测及后续实验。
QIAamp DNA Mini Kit按照说明书进行并改进，具体步骤如下：
• 在沉淀中加入180μl ATL和20μl 蛋白酶K，振荡混匀。将离心管置于金属浴或空气摇床中，56°C振荡2h；
• 从金属浴或空气摇床中取出离心管，进行短暂离心。在离心管中加入200μl AL，振荡混匀；
• 离心管置于金属浴中，70°C 振荡10min，将离心管短暂离心；
• 在离心管中加入200μl 新鲜的无水乙醇，振荡混匀，短暂离心；
• 将离心管中的液体全部转入到Qiagen柱中。8000rpm离心1min，弃去废液，保留柱子；
• 将柱子转入到一个新的废液收集管中，加AW1 500μl。8000rpm离心1min，弃去废液，保留柱子；
• 将柱子转入到一个新的废液收集管，加AW2 500μl。13000rpm离心3min, 弃去废液，保留柱子；
• 将柱子转入到一个新的废液收集管中，最高转速离心1min。将柱子转入到一个新的1.5ml离心管，在生物安全柜中打开盖，晾2min；
• 在柱子中加入100μl buffer AE，盖盖放置5min。8000rpm离心1min，收集洗脱出的液体（含目标DNA）；
• 将收集的含DNA液体重新加入柱子中，盖上盖子放置5min。8000rpm离心1min，收集DNA，弃去柱子；
• 将收集到的DNA分装出2份，每份25μl。将提取到的DNA置-80℃冷冻保存。
4.结果
两种核酸提取方法用于临床标本检测的比较
胃液标本35例（RUT+），分别用上述两种提取方法抽提HP核酸模板，实验反应体系及反应条件见上，荧光定量检测结果如表1和图1所示。比较两种提取方法在测定HP特
异基因及内参基因的差别是否具有统计学意义，采用多元方差分析，Wilks’λ=0.96，F=0.73，P=0.49>0.05，结果表明两种核酸提取方法在检测HP特异基因及内参基因的效果相当，说明两种提取方法在临床标本中的检测能力无显著差别。
两种核酸抽提方法，EmerTher的操作过程简单、时间短，提取效率及临床标本检测能力与QIAGEN相当，在大规模临床标本筛查时应优先选择性价比高的提取方法。
目录号 | 规格 | 适用机型 |
|---|---|---|
DE01001 | 20份 | 瓶装，适用于手工提取及Tecan、Hamilton等全自动移液工作站 |
DE01002 | 100份 | 瓶装，适用于手工提取及Tecan、Hamilton等全自动移液工作站 |
DE01003 | 500份 | 瓶装，适用于手工提取及Tecan、Hamilton等全自动移液工作站 |
DE0196A | 96份 | Thermo Scientific KingFisher等多种自动磁珠纯化仪 |
DE0196B | 96份 | 医脉赛、圆点、奥盛、天隆、天根等品牌多种纯化机型 |
DE0160C | 60份 | Thermo Scientific KingFisher mL等多种自动磁珠纯化仪 |
DE0196D | 96份 | Thermo Scientific KingFisher Flex等多种自动磁珠纯化仪 |
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【手工提取步骤】
1. 溶解蛋白酶K：按标签所示，吸取PK溶解液至蛋白酶K干粉中配制成蛋白酶K溶液20mg/ml，颠倒混匀数次让蛋白酶K充分溶解；
2. 取200-300µl液体样本放入2ml离心管中，加入20μl蛋白酶K溶液、700µl裂解吸附液、30µl磁珠；
3. 置于旋转混和仪，充分混匀30min；
4. 用磁分离架吸附磁珠1min，弃上清液；
5. 加入800µl洗涤液I洗涤磁珠，将含磁珠的洗涤液转移至另一干净离心管中，颠倒混匀洗涤10min，吸附磁珠，弃上清液；
6. 加入800µl洗涤液I洗涤磁珠3min，吸附磁珠，弃上清液；
7. 加入800µl洗涤液II洗涤磁珠3min，吸附磁珠，弃上清液；
8. 再次加入800µl洗涤液II洗涤磁珠3min，吸附磁珠，弃上清液后静置5min，去除乙醇残留；
9. 加入100µl洗脱液，60℃混合洗脱10min；
10. 磁场吸附磁珠，回收含基因组DNA的洗脱液至另一离心管，用于后续检测或-20°C储存。
【自动化提取步骤（以32通道为例）】
1. DE0196B预装板设置（96孔板深孔板，样品量200μl，16通量）
2.从试剂盒中取出预封装96深孔板，轻甩96深孔板使试剂及磁珠均集中到96深孔板底部。使用前小心撕去铝箔封口膜，避免96深孔板振动，防止液体溅出（注意：室温低于
15℃时，请在使用前将96孔板置于37℃预热20min，以避免沉淀析出）；
3.在第1列、第7列中加入200μl样本和20μl蛋白酶K溶液；
4.放置2个8道磁套；选择附表所列的自动化提取程序，开始提取；客户可按所使用的核算自动提取仪适当调整程序，如有问题，请联系技术支持；
5.转移第6列、第12列中含核酸的洗脱液，用于后续检测或-20℃储存。
| 次序 | 列号 | 程序 | 混合时间（sec.） | 磁吸时间（sec.） | 等待时间（sec.） | 体积（μL） | 混合速度 | 温度（℃） |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 1 | 裂解 | 900 | 0 | 0 | 900 | 快 | 50 |
| 2 | 2 | 吸磁 | 30 | 20 | 0 | 800 | 中 | 室温 |
| 3 | 1 | 结合 | 600 | 30 | 0 | 900 | 快 | 50 |
| 4 | 2 | 洗涤1 | 600 | 20 | 0 | 800 | 快 | 室温 |
| 5 | 3 | 洗涤2 | 240 | 20 | 0 | 800 | 快 | 室温 |
| 6 | 4 | 洗涤3 | 180 | 20 | 0 | 800 | 快 | 室温 |
| 7 | 5 | 洗涤4 | 180 | 30 | 120 | 800 | 快 | 室温 |
| 8 | 6 | 洗脱 | 420 | 60 | 0 | 150 | 快 | 70 |
| 9 | 4 | 移动磁场 | 30 | 0 | 0 | 800 | 快 | 室温 |
1、血液样本基因组DNA提取方法？
答：磁珠法全血样本基因组DNA提取通常分为两类：
一步裂解法：将全血样本直接加入裂解结合液后上机提取；
两步裂解法：将全血样本与红细胞裂解液混合，待红细胞细胞膜破裂后，离心收集白细胞，加入裂解结合液后上机提取。
一步裂解法适应于各种血液，包括新鲜血液、冻存血液、去血浆血细胞等，通常血液处理量为10µl到300µl；
两步裂解法适用于白细胞结构完整的新鲜血液，通过离心后可对毫升级血液中白细胞进行富集后提取，可获得大量基因组DNA；因操作过程涉及裂解红细胞及离心收集白细
胞，需注意保存样本中血细胞结构完整，过程较为繁琐。
2、在哪些情况下选择血液作为分子诊断DNA的来源
采用非侵入性的唾液及拭子采样可对遗传信息进行普通遗传分析，在下列情况下，推荐通过血液作为样本做为核酸来源：
1）需去除外源核酸干扰的分析，如二代测序NGS等；
2）细胞内寄生等感染性疾病检测；
3）白细胞、造血细胞及血小板基因及变异分析；
4）临床个性化及靶向用药分析；
5）其他适应的条件。
