镍亲和纯化磁珠是由超顺磁性纳米颗粒与Ni-NTA（nickel-chargednitrilotriacetic acid）共价偶联而成。EmerTher镍亲和纯化磁珠具有快速磁响应性，高蛋白结合能力和低非特异性结合，可快速有效地从细胞粗提液中分离纯化His-tag融合蛋白。
操作流程（示意图）：
镍（His-tag）亲和纯化磁珠的应用实例见下：
1）纯化镍融合蛋白
2）图一：IPTG诱导重组大肠杆菌过表达绿色荧光蛋白（GFP），经NI亲和磁珠纯化过的绿色荧光蛋白结果图，其中GFP母液为超声破碎大肠杆菌悬液，GFP为纯化后的目的蛋白绿色荧光蛋白。
图二：IPTG诱导重组大肠杆菌过表达绿色荧光蛋白（GFP）及红色荧光蛋白（RFP），经Ni亲和磁珠纯化前后的GFP及RFP溶液在紫外光照射下发出荧光图。
| 目录号 | 规格 | 适用机型 |
|---|---|---|
| AE04001 | 50mg/ml，1ml | 略 |
| AE04002 | 50mg/ml，5ml | 略 |
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【手工实验步骤】
本实验步骤提供一般操作流程，针对每个特定融合蛋白，请根据His-tag融合蛋白纯化原理、目标蛋白表达量及其性质进行优化及预处理。
A. 纯化步骤
根据His-tag融合蛋白的表达情况，相应选择非变性条件或变性条件所需缓冲液来纯化：如果His-tag融合蛋白已经释放到细胞裂解液中，可使用非变性条件下纯化；如果
His-tag融合蛋白还在包涵体中，需在变性条件下释放蛋白后再纯化。
1. 振荡悬浮磁珠，吸取20µl磁珠（1mg）加入1.5ml灭菌离心管中；
2. 加500µl His-tag结合缓冲液或变性结合缓冲液，洗涤磁珠，磁场吸附，弃去上清液；
3. 将磁珠重悬于200-750µl His-tag结合缓冲液中或变性结合缓冲液；
4. 加入等体积200-750µl细胞裂解液，轻柔振荡悬浮，在室温孵育30min；
5. 磁场吸附，弃去上清液；
6. 加入1ml 洗涤缓冲液洗涤3-5次，每次5min，磁场吸附，弃去上清液；
7. 加入100µl含500mM imidazole的洗脱缓冲液，洗脱15分钟；
8. 磁场吸附，将洗脱缓冲液移至干净的灭菌离心管；需要的话可重复洗脱一次，合并洗脱液；
9. 使用蛋白浓度测定及SDS-PAGE检测洗脱产物。
B. 磁珠再生
1. 洗脱目标蛋白后，加入500µl剥离缓冲液处理磁珠3次，每次5min；
2. 磁场吸附，弃去上清液；加入500µl蒸馏水洗涤3次后，加入1ml再生平衡液，平衡30min；
3. 磁场吸附，弃去上清液；磁珠重悬并保存于20%乙醇溶液。
A. His-tag融合蛋白的回收率低，怎么解决？
1. 蛋白可能会降解；可在细胞裂解液中添加蛋白酶抑制剂。
2. 磁珠用量不足；增加磁珠的用量。
3. 样品中His-tag融合蛋白含量低。提高蛋白表达量或增加样品的用量。
B. 蛋白纯度差，怎么解决？
洗涤不足；调整咪唑在结合缓冲液和/或洗涤缓冲液中的浓度。洗涤磁珠至少两次以上。
C. 在洗脱样品中发现非特异性蛋白质，怎么解决？
1. 蛋白可能会降解。可在细胞裂解液中添加蛋白酶抑制剂。
2. 非特异性蛋白质结合到磁珠上。调整结合、洗涤和洗脱缓冲液中的咪唑浓度。
