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【手工实验步骤】

以下实验步骤提供EmerTher氨基磁珠的一般操作流程，具体实验中磁珠的用量可以适当调整。针对不同的用途，建议对偶合的条件（蛋白质浓度、偶联溶液、pH和孵育时

间）进行相应的优化。EmerTher氨基磁珠的活化反应条件不只限于本文所述，其他常用活化条件也是适用的。

A. 磁珠活化

1. 使用前颠倒混匀磁珠；

2. 取50µl磁珠 (1mg) 放入微量离心管；

3. 将离心管放入磁力架, 吸附磁珠并去上清；

4. 用1ml偶联溶液洗涤磁珠，洗涤3次，每次洗涤完后吸附磁珠并去上清；

5. 将磁珠重悬于400µl 5% 戊二醛溶液，振荡混匀；

6. 温和旋转条件下，在室温反应3小时；

7. 吸附磁珠，弃上清；

8. 加入1ml偶联溶液洗涤磁珠除去未反应的戊二醛，洗涤3次，每次洗涤完后吸附磁珠并去上清。

B. 蛋白偶合

1. 在离心管中加入200µl蛋白溶液，重悬活化好的磁珠；将离心管放置于旋转混合仪，在室温下或4°C温和混合24小时；

2. 通过磁场分离磁珠，弃上清；

3. 加入800µl封闭溶液，振荡混匀，在室温下温和混匀30min；

4. 吸附磁场，弃上清；

5. 加入1ml洗涤缓冲液洗涤磁珠3次，每次洗涤完后吸附磁珠并去上清；

6. 将磁珠重悬于1ml洗涤缓冲液或其它合适的缓冲液，偶联蛋白后的磁珠储存于2-8°C。

C． 注意事项

1. 以上的操作流程适合于将含氨基的配体偶联在 EmerTher 氨基磁珠上。EmerTher氨基磁珠也可以与含羧基的配体偶联。一般常规的氨基磁珠反应也都适用。

2. 偶联溶液的离子强度对提高偶合效率很重要。一般来说，偶联溶液的离子强度越低越好，而且偶联溶液不应含任何氨基 (如Tris) 或羧基（如乙酸酯和柠檬酸），但洗涤缓

冲液或保存液可以含氨基或羧基。

3. 反应的蛋白浓度需要优化，蛋白浓度太低会导致磁珠交联。对于昂贵的蛋白，如果蛋白浓度太低，可以加入别的蛋白（如BSA）占据剩余的反应活性位点。

4. 含戊二醛或吡啶的溶液具有挥发性和毒性，请在化学通风橱里进行相应操作。

5. 磁珠使用和保存过程中应避免冷冻、干燥和高速离心等操作，这些操作会降低磁珠结合能力。

1、偶联溶液的离子强度对偶合效率是否影响？
答：一般来说，偶联溶液的离子强度越低越好，而且偶联溶液不应含任何氨基 (如Tris) 或羧基（如乙酸酯和柠檬酸），但洗涤缓冲液或保存液可以含氨基或羧基。

2、反应的蛋白浓度是否需要优化？
答：蛋白浓度太低会导致磁珠交联。对于昂贵的蛋白，如果蛋白浓度太低，可以加入别的蛋白（如BSA）占据剩余的反应活性位点。