用于指甲、毛发样本中DNA的提取。试剂盒由高效吸附核酸的超顺磁性纳米微球和安全稳定的提取试剂体系组成:经过表面修饰的磁珠,结合核酸能力更强;洗脱容易,使用TE缓冲液或水即可将基因组DNA从磁珠洗脱下来,适合于微量组织、指甲、毛发中DNA的自动化提取过程。
操作流程(示意图):
磁珠法法医样本DNA提取试剂盒在提取毛发DNA的应用实例见下:
目录号 | 规格 | 适用机型 |
---|---|---|
DE10001 | 20份 | 瓶装,适用于手工提取及Tecan、Hamilton等全自动移液工作站 |
DE10002 | 100份 | 瓶装,适用于手工提取及Tecan、Hamilton等全自动移液工作站 |
DE1096B | 96份 | 医脉赛、圆点、奥盛、天隆、天根等品牌多种纯化机型 |
DE1060C | 60份 | Thermo Scientific KingFisher mL磁珠提取仪 |
DE1096D | 96份 | Thermo Scientific ingFisher Flex纯化系统 |
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【手工提取步骤】
1.溶解蛋白酶K:按标签所示,吸取PK溶解液至蛋白酶K干粉中配制成蛋白酶K溶液20mg/ml,颠倒混匀数次让蛋白酶K充分溶解;
2.用剪刀剪下约100mg的指甲(尽量剪碎便于消化)或者3-5根带毛囊的毛发,放入离心管中;
3.加入200µl消化液,20μl蛋白酶K溶液,置于56°C恒温振荡仪,消化4-8h或过夜;
4.吸取消化后的溶液至离心管中,加入20µl提取磁珠,轻微摇动混匀;
5.加入400µl核酸吸附液,置于旋转混和仪,混匀20min;
6.用磁分离架吸附磁珠,弃上清液;
7.加入400µl洗涤液I洗涤磁珠,颠倒混匀洗涤2min,吸附磁珠,弃上清液;
8.再次加入400µl洗涤液I洗涤磁珠2min,吸附磁珠,弃上清液;
9.加入400µl洗涤液II洗涤磁珠2min,吸附磁珠,弃上清液;
10.再次加入400µl洗涤液II洗涤磁珠2min;
11.吸附磁珠,弃上清液后静置3min,去除乙醇残留;
12.加入50µl洗脱液,置于56°C恒温振荡仪,洗脱5min;
13.磁场吸附磁珠,回收含基因组DNA的洗脱液至另一离心管,进行DNA检测及后续实验。
【自动化提取步骤(以32通道为例)】
1.DE1096B预装板设置(96孔深孔板,样品量300μL,16通量)
2.用剪刀剪下约100mg的指甲(尽量剪碎便于消化)或者3-5根带毛囊的毛发,放入离心管中;
3.加入300μL ATL和20μL蛋白酶K溶液置于56℃恒温振荡仪,消化4-8h或过夜;
4.取出预分装96深孔板,轻甩96深孔板使试剂及磁珠均集中到96深孔板底部。使用前小心撕去铝箔封口膜,避免96深孔板振动,防止液体溅出(注意:室温低于15℃时,
在开封使用前96孔板置于37℃预热20min,以避免沉淀析出);
5.第1、7列中加入消化好的样本溶液;
6.放置2个8道磁套;选择附表所列的自动化提取程序开始提取;客户可按所使用的自动核酸提取仪适当调整程序,如果有问题,请联系技术支持;
7.转移第6列、第12列中含核酸的洗脱液,用于后续检测或-20℃储存。
次序 | 列号 | 程序 | 混合时间(sec.) | 磁吸时间(sec.) | 等待时间(sec.) | 体积(μL) | 混合速度 | 温度(℃) |
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1 | 1 | 裂解 | 600 | 0 | 0 | 900 | 快 | 37 |
2 | 2 | 吸磁 | 30 | 20 | 0 | 900 | 中 | 室温 |
3 | 1 | 结合 | 900 | 20 | 0 | 900 | 快 | 37 |
4 | 2 | 洗涤1 | 300 | 20 | 0 | 900 | 快 | 室温 |
5 | 3 | 洗涤2 | 300 | 20 | 0 | 900 | 快 | 室温 |
6 | 4 | 洗涤3 | 180 | 20 | 0 | 900 | 快 | 室温 |
7 | 5 | 洗涤4 | 180 | 30 | 180 | 900 | 快 | 室温 |
8 | 6 | 洗脱 | 420 | 60 | 0 | 100 | 中 | 50 |
9 | 4 | 移动磁场 | 30 | 0 | 0 | 900 | 快 | 室温 |
1.基因组DNA得率低,蛋白残留高,有什么原因呢?
A.指甲、毛发等组织未充分消化。要确保指甲、毛发在消化过程中完全浸没于液体中。
B.裂解不充分。加入核酸吸附液后应充分摇匀及振荡样品以促进细胞裂解。
C.磁珠加样量不足,请在吸取磁珠前将含磁珠的溶液充分混匀。
D.与磁珠结合不充分。在DNA与磁珠结合过程中请温和混匀,确保DNA与磁珠充分结合。
E.样品没有按照要求保存导致基因组DNA降解。
2.获得的DNA条带弥散,DNA片段断裂,有什么原因呢?
A.样品没有按照要求保存,请使用新鲜及正确保存的样品。
B.操作过程过于剧烈,DNA被机械打断,请严格按照说明书操作。
3.DNA样品不纯,抑制或者干扰后续试验,有什么原因呢?
A.磁珠没有完全干燥,有乙醇残留,最后一次洗涤后尽量吸净离心管内的液体。
B.加入洗脱液之前将磁珠室温静置3-5min,确保乙醇完全挥发,也要避免过度干燥导致DNA不容易从磁珠上洗脱下来,减少提取量。