链霉亲合素（Streptavidin）磁珠的应用实例见下：

纯化后的抗体-药物偶联物（Antibody-drug conjugation）ADC A 的 LC-MS/MS 定量分析谱图 （先将ADC A的抗体用生物素标记，再和医脉赛链霉亲和素磁珠通过链霉亲和

素-生物素反应欧联，最后用偶联的磁珠从血浆中纯化ADC A后定量； IS：内标物

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【手工实验步骤】

本实验步骤提供一般操作流程，实验具体条件以及所需磁珠用量可根据特定应用由用户进行优化。

A. 生物素标记蛋白抗体的固定

1. 颠倒混匀磁珠，吸取所需要量的磁珠（如10µl，0.2mg）加入1.5ml灭菌离心管中；

2. 加1ml蛋白结合/洗涤缓冲液，洗涤磁珠，磁场吸附，弃上清液；

3. 将磁珠重悬于1ml蛋白结合/洗涤缓冲液，加入100-200µl含生物素标记蛋白的样品，轻柔振荡，在室温下孵育15-60分钟；

4. 磁场吸附，弃去上清液；

5. 加入蛋白结合/洗涤缓冲液（每次1ml）洗涤磁珠3-5次，每次5min，磁场吸附，弃去上清液；

6. 将磁珠重悬在合适的缓冲液中，用于下游实验。

B. 生物素标记核酸的固定

1. 颠倒混匀磁珠，吸取所需要量的磁珠（如10µl，0.2mg）加入1.5ml灭菌离心管中；

2. 加1ml核酸结合/洗涤缓冲液，洗涤磁珠，磁场吸附，弃上清液；

3. 将磁珠重悬于500µl核酸结合/洗涤缓冲液，加入100-200µl含生物素标记分子的核酸样品中，轻柔振荡，在室温下孵育10-15分钟；

4. 磁场吸附，弃去上清液；

5. 加入500µl核酸结合/洗涤缓冲液洗涤磁珠3-5次，每次2min，磁场吸附，弃去上清液；

6. 将磁珠重悬在合适的缓冲液中，用于下游实验。

【固定生物素标记的RNA，请在核酸结合/洗涤液中加入RNase Inhibitor.】

C. 分离生物素标记分子

链霉亲和素-生物素相互结合的强度很高，只有在特定条件下才能把生物素标记的分子从磁珠上洗脱下来：

1. 标记蛋白的解离：将固定有蛋白分子的磁珠重悬于SDS-PAGE reducing sample buffer，煮沸5分钟，再用磁场分离，以获得含蛋白分子的上清液，可用于

SDS-PAGE凝胶电泳等检测。

2. 标记核酸的解离：将固定有DNA的磁珠重悬于10mM EDTA (pH 8.2)，95% formamide，在65°C孵育5分钟或90°C孵育2分钟，以解离DNA。

3. 分离生物素与链霉亲和素的处理过程会使链霉亲和素蛋白变性，因此磁珠不能被重新使用。

1、链霉亲和素磁珠能用于免疫沉淀吗？

答：可以，链霉亲和素磁珠可直接和生物素标记的分子结合，再通过磁场分离，得到纯化的分子-磁珠复合物，用于下游的各种实验，包括核酸分析、分离纯化靶蛋白、

SDS-PAGE凝胶电泳检测以及质谱分析等。链霉亲和素磁珠也可用于间接免疫沉淀。生物素标记的抗体先和样品反应，在溶液中形成抗原-抗体复合物，然后加入链霉亲

和素磁珠捕获抗原-抗体复合物。这种方法适合于当抗原抗体浓度低，抗原抗体结合动力学缓慢、亲和力较弱，或抗原抗体结合需要特定的分子取向的情况。

2、样品中如果含有游离生物素，是否会减少链霉亲和素磁珠和生物素标记的分子的结合？

答：会的，但游离生物素可以通过超滤，透析或其他分离方法来除去。

3、链霉亲和素磁珠和生物素标记的分子结合的效率如何测定？

答：可以通过结合前后分子浓度的比较来确定。

4、如何减少非特异性结合？

答：可在结合/洗涤缓冲液中添加洗涤剂，如0.01-0.1％的Tween-20，以减少非特异性结合。

5、何种操作会在磁珠的使用和保存过程产生影响？

答：磁珠使用和保存过程中应避免冷冻、干燥和高速离心等操作，这些操作会降低磁珠结合能力。

6、链霉亲和素磁珠提取的底物可直接用于下游的液相-质谱（LC-MS/MS）分析吗？

答：可以。