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镍(His-tag)亲和纯化磁珠

分类:镍 (His-tag) 亲和纯化目录:AE04

产品特性:

粒径:500nm
pH 稳定性:pH3-12
每mg微球结合约10-60μg融合蛋白
最大程度保持蛋白活性
设备简单

医脉赛(EmerTher)镍亲和纯化磁珠是由超顺磁性纳米颗粒与Ni-NTA(nickel-chargednitrilotriacetic acid)共价偶联而成。EmerTher镍亲和纯化磁珠具有快速磁响应性,高蛋白结合能力和低非特异性结合,可快速有效地从细胞粗提液中分离纯化His-tag融合蛋白。

操作流程(示意图):

医脉赛(EmerTher)镍(His-tag)亲和纯化磁珠的应用实例见下:

1)纯化镍融合蛋白

2)图一:IPTG诱导重组大肠杆菌过表达绿色荧光蛋白(GFP),经NI亲和磁珠纯化过的绿色荧光蛋白结果图,其中GFP母液为超声破碎大肠杆菌悬液,GFP为纯化后的目的蛋白绿色荧光蛋白。
图二:IPTG诱导重组大肠杆菌过表达绿色荧光蛋白(GFP)及红色荧光蛋白(RFP),经Ni亲和磁珠纯化前后的GFP及RFP溶液在紫外光照射下发出荧光图。

目录号规格适用机型
AE0400150mg/ml,1ml
AE0400250mg/ml,5ml

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【手工实验步骤】
本实验步骤提供一般操作流程,针对每个特定融合蛋白,请根据His-tag融合蛋白纯化原理、目标蛋白表达量及其性质进行优化及预处理。
A. 纯化步骤
根据His-tag融合蛋白的表达情况,相应选择非变性条件或变性条件所需缓冲液来纯化:如果His-tag融合蛋白已经释放到细胞裂解液中,可使用非变性条件下纯化;如果His-tag融合蛋白还在包涵体中,需在变性条件下释放蛋白后再纯化。
1. 振荡悬浮磁珠,吸取20µl磁珠(1mg)加入1.5ml灭菌离心管中;
2. 加500µl His-tag结合缓冲液或变性结合缓冲液,洗涤磁珠,磁场吸附,弃去上清液;
3. 将磁珠重悬于200-750µl His-tag结合缓冲液中或变性结合缓冲液;
4. 加入等体积200-750µl细胞裂解液,轻柔振荡悬浮,在室温孵育30min;
5. 磁场吸附,弃去上清液;
6. 加入1ml 洗涤缓冲液洗涤3-5次,每次5min,磁场吸附,弃去上清液;
7. 加入100µl含500mM imidazole的洗脱缓冲液,洗脱15分钟;
8. 磁场吸附,将洗脱缓冲液移至干净的灭菌离心管;需要的话可重复洗脱一次,合并洗脱液;
9. 使用蛋白浓度测定及SDS-PAGE检测洗脱产物。
B. 磁珠再生
1. 洗脱目标蛋白后,加入500µl剥离缓冲液处理磁珠3次,每次5min;
2. 磁场吸附,弃去上清液;加入500µl蒸馏水洗涤3次后,加入1ml再生平衡液,平衡30min;
3. 磁场吸附,弃去上清液;磁珠重悬并保存于20%乙醇溶液。

A. His-tag融合蛋白的回收率低,怎么解决?
1. 蛋白可能会降解;可在细胞裂解液中添加蛋白酶抑制剂。
2. 磁珠用量不足;增加磁珠的用量。
3. 样品中His-tag融合蛋白含量低。提高蛋白表达量或增加样品的用量。

B. 蛋白纯度差,怎么解决?
洗涤不足;调整咪唑在结合缓冲液和/或洗涤缓冲液中的浓度。洗涤磁珠至少两次以上。

C. 在洗脱样品中发现非特异性蛋白质,怎么解决?
1. 蛋白可能会降解。可在细胞裂解液中添加蛋白酶抑制剂。
2. 非特异性蛋白质结合到磁珠上。调整结合、洗涤和洗脱缓冲液中的咪唑浓度。